ANIMALI TRANSGENICI PDF

Un aspetto importante della ricerca e worm è la capacità di utilizzare animali transgenici per studiare la localizzazione dei geni e la funzione. Animali transgenici. Title, L’Eldorado della nuova biologia: clonazione, animali transgenici, cellule staminali. Volume 27 of Prometheus (Milan, Italy) · Volume 27 of Prometheus. (1)Dipartimento di Fisiopatologia e Medicina Sperimentale, Centro di Ateneo per lo Studio degli Animali Transgenici, Università degli Studi di Siena, Via Aldo.

Author: Digis Braran
Country: Iceland
Language: English (Spanish)
Genre: Video
Published (Last): 1 August 2007
Pages: 297
PDF File Size: 2.59 Mb
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ISBN: 488-2-99354-874-5
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Seminario Animali Transgenici

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Vermi transgenici sono comunemente utilizzati in Hochbaum, D. Generation of Transgenic C. Click here for the english version.

For other languages trznsgenici here. Il numero di laboratori che si servono libero nematode C. Inoltre, l’analisi della C. Animali transgenici possono essere create sia tramite microiniezione della linea germinale verme o attraverso l’uso di bombardamento biolistic. Qui descriviamo un semplice protocollo per generare i vermi transgenici dai bombardamenti biolistic con particelle d’oro con il Bio-Rad sistema PDS Rispetto a microiniezione del DNA in ermafrodita germinale, questo protocollo ha il vantaggio di non richiedere particolari competenze da parte dell’operatore per quanto riguarda l’identificazione o l’esecuzione di anatomia verme microiniezione.

Anche in contrasto con microiniezione, bombardamento biolistic produce animali transgenici con entrambi gli array extracromosomico e transgeni integrato. Tradizionalmente vermi transgenici sono stati generati da microinjecting DNA transgene nel C. Anche se di successo, questo transgeici richiede attrezzature specializzate e lo sviluppo di esperienza con l’anatomia vite anomali fine e la tecnica di microiniezione. Questo approccio richiede investimenti meno tempo in termini di pratica per avere successo.

Il bombardamento biolistic di C. Questi possono essere coltivate in diversi modi, ma usiamo le piastre uovo per ridurre il lavoro e numero di piatti coinvolti. Abbiamo adattato il nostro protocollo, in parte dal lavoro di Berezikov et al 7. Ceppi di vite senza fine portando questa mutazione sono gravemente scoordinato e poco movimento, sono losca in apparenza, e non sono in grado di formare le larve dauer 8. Ceppi diversi portando il gene unc sono disponibili presso il C.

Animalli DP38 ceppo unc ED3 comporta anche un estraneo Dauer-formazione costitutivo daf-c mutazione che potrebbe influenzare gli esperimenti a valle.

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Se necessario, utilizziamo HT per transgenicj i vermi transgenici per rimuovere il daf-c mutazione. Recentemente abbiamo descritto un protocollo semplice per aggiungere un unc cassette a qualsiasi plasmide contenente un gene di resistenza all’ampicillina per ricombinazione omologa 11 transgenjci un metodo per modificare fosmids verme per trasportare il gene unc da Cre-lox ricombinazione di generare animali transgenici I plasmidi sono disponibili presso Addgene Inc.

Di conseguenza, la produzione di routine grappolo di vermi transgenici per ridurre il lavoro necessario per generare ciascuno. Le piastre uovo hanno anche il vantaggio di supportare la crescita di un gran numero di vermi in modo da poche piastre sono necessari Di solito 5 piatti uova sono animaki per crescere worm per un bombardamento.

Sono necessari anche senza macchia e macchiato 10 centimetri piatti NGA. Le piastre senza macchia deve essere versata in anticipo e lasciati asciugare completamente per facilitare l’assorbimento del liquido aggiunto con i vermi.

Il giorno del bombardamento, laviamo via i vermi prima poi iniziare a preparare il DNA particelle rivestite d’oro. Poi aggiungiamo i vermi alle piastre senza macchia NGA e finire il lavaggio delle particelle d’oro e di trasferirli al macrocarriers. Mantenere tranzgenici vermi sul ghiaccio impedisce loro di muoversi sul piatto e aggregando in pile.

Assicurarsi di effettuare un bombardamento vuoto prima dell’esperimento per irrigare elio attraverso il sistema. Il successo del protocollo per quanto riguarda l’ottenimento di animali transgenici dipende dal transgene particolare. Please recommend JoVE to your librarian. Poliammine cationiche, come spermidina, proteggere il DNA dalla degradazione nucleasi in vivo.

Per facilitare posizionando il gene unc sul snimali plasmide, abbiamo recentemente descritto un protocollo utilizzando la ricombinazione omologa per inserire il gene unc nel gene di resistenza all’ampicillina di quasi tutti i plasmidi Inoltre, per facilitare transgeni in movimento dal ceppo DP38 in ceppi manca il verme unc mutazione, abbiamo anche generato un plasmide con unc fuso a mCherry Alcuni transegnici potrebbe essere difficile da rilevare dopo il bombardamento a causa di espressione debole o un’espressione specifica fase.

Per i transgeni con espressione debole, eseguendo bombardamenti aggiuntivi possono condurre all’identificazione di linee con forte espressione.

The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. The anumali has been corrected from:. The spermidine is transgenicu in aqueous solution. We then add 1mL of water right before use to obtain a 0.

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Preparare LB ml in una bottiglia znimali ml. Autoclave per 20 min. Autoclave una bottiglia di ml pergiorno successivo. Separare i tuorli di 10 uova di gallina nella bottiglia sterile. Usiamo un separatore tuorlo disponibile nei negozi per la casa, tra cui Target. Portare il volume di mL con LB. Raffreddare a temperatura ambiente. Aggiungere 40 ml di OP Scuotere Distribuire ml di miscela per piastra. Lasciare le piastre a stabilirsi a temperatura ambiente per una notte.

Delicatamente versare il liquido rimanente dalle piastre. Lasciare asciugare con coperchi su a temperatura ambiente per una notte. Queste placche sembrano essere OK per l’uso per mesi. Isolare le uova dal DP38 worm attraverso l’uso di ipoclorito di 13, Risospendere le uova in sterili buffer S-basale o M9 13, Le piastre saranno pronti per l’uso una volta che il worm hanno iniziato a cancellare il cibo dalle piastre.

Pesare 60 mg di particelle d’oro in un tubo 1. Spin brevemente a precipitare le particelle d’oro. Lavare 3 volte in acqua sterile e girare per un breve istante per raccogliere l’oro.

Float il DP38 vermi fuori transtenici piatti uovo con tampone S-basale o M9 e trasferirli in una provetta da 50mL conica. Mantenere i tubi in panchina fino a quando i vermi sono sul aanimali. Poi aspirare il tampone e aggiungere nuovi S-basale o M9.

Aspirare e lasciare circa mL di vermi in un tampone per bombardamento. Trasferire in una tavola 10 centimetri senza macchia NGA sul ghiaccio. Assicurarsi di coprire l’intera superficie del piatto con i vermi. Lasciare piatto ad asciugare su ghiaccio. Preparazione del DNA per un bombardamento: Mescolare in un tubo 1.

Risospendere accuratamente prima di aggiungere. Vediamo poca differenza tra il DNA circolare o lineare.

Siamo quindi aggiungere 1 ml di acqua a destra prima dell’uso per ottenere una soluzione 0,1 M. Questa soluzione deve essere preparata fresca ogni bombardamento. Di solito vortice le particelle d’oro in un tubo 1. Abbiamo anche usato al posto di protamina spermidina con ottimi risultati Se usiamo protamina, di solito incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti invece di mettere sul ghiaccio.

Incubare la miscela in ghiaccio per 30min, e periodicamente mix di tenere le particelle d’oro in sospensione. Poi girare brevemente e aspirare il surnatante. Metterle su una carta assorbente e lasciarli asciugare a temperatura ambiente. Assicurati di destra vortex prima pipettaggio per mantenere l’oro in sospensione. Bombardamento Assicurarsi di effettuare un bombardamento vuoto prima dell’esperimento per irrigare elio attraverso il sistema.

Accendere la pompa del vuoto e chiudere trappola pompa del vuoto.